麻豆xxxxhd videos-麻豆按摩-麻豆成人传媒一区二区-麻豆传煤一区免费入-久久秋霞理伦片-久久青娱乐

影響Taq DNA聚合酶的四大因素

Taq DNA聚合酶是第yi個被發現的熱穩定DNA聚合酶，分子量65kD，開始由Saiki等從溫泉中分離的一株水生噬熱桿菌（thermus aquaticus）中提取獲得。此酶能耐高溫，在70℃反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%；在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列測定并可利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對DNA的特定片段進行體外擴增。在PCR過程中，由于Taq DNA聚合酶在變性步驟中（約94℃）不失活，可直接進入第二輪循環，因此不必每輪循環時重新加入新酶，這使得Taq DNA聚合酶成為PCR反應中的*用酶。

（一）溫度：雖然Taq DNA聚合酶有很強的溫度適應范圍，但高于60℃的環境仍會使部分酶變性失活。反之，如果溫度低于正常值，酶活性受到限制。而且由于引物在低溫下（特別是25—27℃）可能與基因組中別的部分同源序列結合，使得一些擴增產物并非為目的序列。適當提高溫度，錯配堿基多會解離，反應產物特異性增加。
（二）鎂離子濃度：Taq DNA聚合酶活性對Mg2+的濃度非常敏感。Taq DNA聚合酶和許多其他聚合酶一樣，是Mg2+依賴性酶。用鮭魚精DNA作模板，dNTP的總濃度為0.9~0.8mmol/L，用含不同濃潑MgCl2的PCR系統使反應進行10分鐘。測定結果表明：在MgCl2為2.0mmol/L條件下，酶活性顯示盈高。Mg2+濃度偏高，酶活性會受到限制，10mmol/LMgCl2使酶活性抑制約50%。由于Mg2+可以與負離子或負離子團（如根）結合，而在PCR中，DNA模板、引物以及dNTP是根的主要來源，其中dNTP占有很大比例。因此反應系統中，Mg2+的濃度還要受到dNTP濃度的影響，欲獲得反應結果，要對反應條件進行必要的探索。每當一個新的目的片段和引物第yi次使用時，或者某種參數（dNTP或引物濃度）改變時，應進行Mg2+的濃度滴定。一個普遍的原則是，樣品中Mg2+的濃度至少要比dNTP總濃度高0.5~1.0mmol/L。
（三）KCl的濃度：一般是50mmol/L，高于75mmol/L時，聚鏈反應就受到明顯的限制。當KCl濃度高達200mmol/L以上時，聚鏈反應就受到明顯的限制，此時反應進行10分鐘仍無核苷摻入．濃度均為50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl對TaqDNA聚合酶活性影響則分別為中等抑制、無影響以及25~30%促進。
（四）dNTP的濃度：均衡的低濃度dNTP更有利于酶活性的發揮，并能減少錯配，獲得多量的特異性強的DNA反應產物。各種核苷酸濃度為40umol/L的100ulPCR系統可以得到2.6ugDNA產物，而只消耗所提供核苷酸的半量；
（五）幾種變性劑對酶活性的影響：10%乙醇尚不抑制酶活性；二甲基亞砜（DMSO），二甲替甲酰胺（DMF）。甲酰胺在低濃度時對酶活性無影響，隨著它們濃度的提高，酶活性明顯下降。l0%DMSO會使酶活性減半。然而另有研究者觀察到，在某些聚鏈反應系統中，10%DMSO起著有利作用。這種結構各異的現象還表現在用尿素進行的實驗中。1.0mol/L尿素能提高酶活性，2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有報告認為0.5mol/L尿素則*抑制PCR。總之，變性劑對TaqDNA聚合酶以及PCR系統的影響參數有待更多的實驗數據。TaqDNA聚合酶對SDS十分敏感，而某些非離子型去污劑又能*消除低濃度SDS對酶活性的抑制效應。例如，0.5%Twen20及0.5%NP40可抵銷0.01%SDS對酶活性的影響。