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免疫組化（IHC）的原理是，根據抗體與抗原的特異結合來檢測組織切片中的抗原（如蛋白）。詞根immuno是指操作中所使用的抗體，而histo代表著組織。

利用特異的腫瘤標志物，醫生們可以通過IHC診斷腫瘤是良性還是惡性，確定腫瘤的分期和分級，鑒別細胞類型和轉移的來源。IHC也能用于藥物開發，研究者們通過檢測靶點的上調或下調來判斷藥物的療效。

商業化的IHC抗體一般都提供有稀釋和染色的建議，能為你節省許多摸索過程。然而，事情往往沒那么簡單。你的抗體可能沒在IHC中驗證過，或者你的樣本并不標準，又或者實驗就是不像文獻或演示視頻那樣順利，這時我們該怎么辦呢？

“IHC不只與一抗有關，還有緩沖液、抗原修復液和酶，”紐約大學Langone醫學中心的IHC主管Luis Chiriboga說，“這些都是重要的變量。”平衡這些變量是一件相當繁瑣事，而本文介紹的一些小竅門可以幫你簡化這一過程。

首先要有信號

Chiriboga在教學生做IHC時總會說，生成信號是*要務。“你必須先看到信號，才知道接下來要怎么做。” 一開始他通常使用較高的抗體濃度，在抗原表達水平不同的組織中進行測試，以便獲得一個動態范圍。

不過，調整信號就不只是抗體的問題了。“高品質抗體是*要素。但如果用錯了其它試劑，好抗體也會失敗，”CST公司的Katherine Crosby說。

緩沖系統對一抗結合抗原的能力有著深遠的影響。如果你用了抗體供應商推薦的試劑和方案但卻沒有看到理想的結果，就應該及時供應商的。如果你用的是經未測試的抗體，就有必要對pH或離子強度進行調節。

如果實驗仍然檢測不到組織里的抗原，但該抗原的確有表達，那么可能是抗原表位在固定過程中出了問題（比如被掩蓋或變性）。在這種情況下，我們就需要對抗原進行修復。目前的抗原修復基本上是酶處理（比如pronase或trypsin）或者某種形式的加熱，Sigma Aldrich公司的Lynn Stephenson說。

另外，我們還可以嘗試不同的固定劑，用乙醇、甲醇甚至丙酮來取代福爾馬林。“這些試劑會使抗原表位產生不同的改變，”Stephenson指出。

更好的標記體系

一般情況下，抗原識別只是整個過程的一部分。經典IHC方案是用二抗來識別一抗。二抗可以與辣根過氧化物酶（HRP）直接相連，不過更多情況是先用二抗連接生物素，然后用連有酶的鏈霉親和素來進行識別。這樣能形成一個多層次的信號放大系統。

“不過，這樣的系統也可能帶來更多的誤差和背景，”Sigma Aldrich公司的Aaron Sin說。舉例來說，親和素可能識別內源生物素，尤其是在肝臟和腎臟這樣的組織。（延伸閱讀：攻克多重PCR之難）

為此，許多研究者放棄了偶聯生物素的二抗，開始使用一種以聚合物為基礎的試劑。“它們相當于拖著一長串酶的二抗，”Vector Laboratories公司的Craig Pow說，該公司致力于生物試劑蛋白標記和檢測試劑。“這顯然比使用HRP二抗要靈敏得多。”

據Pow介紹，這種試劑的敏感度與生物素/親和素差不多，但使用起來要簡單得多，而且不用擔心內源生物素產生的背景。如果需要更高的敏感度，還可以采用基于多級聚合物的試劑，比如Vector Laboratorieszui近推出的ImmPRESS™ Excel Amplified HRP Polymer Staining Kit。

與酶體系相比，熒光體系能夠更的定位抗體，甚至可以同時成像兩個核抗原。不過，熒光成像的黑色背景不能提供常規顯微鏡那樣的形態學結構。Sigma Aldrich公司的Duolink®系統有足夠的敏感性和特異性，可以通過兩個一抗檢測鄰近的抗原表位。

選擇合適的顏色

IHC中zui常用的酶是HRP和堿性酶（AP），不過它們的效果并非*相同。HRP體系傾向于生成更密集的信號，“與AP相比能提供更細小更清晰的定位，”Pow說。但這并不是說AP就比HRP差，“實際上在某些應用中，正因為AP不那么稠密，反而能展現出更好的形態。”

這兩種酶都有不同的生色底物，可以產生不同顏色的產物。“我們應當選擇合適的顏色和復染劑，”Crosby說。

IHC遠遠不是把抗體放在組織切片上，然后用顯微鏡觀察那么簡單。要想得到實用、可靠而且清晰的結果，就需要耐心的對每一步進行優化。